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  • question 【求助】多酚氧化酶活性测定,测定结果似乎不对

    • answer 能否说得详细些?用的什么试剂盒?标准品是什么?酶粗提液的制备方法?检测波长?
    • answer 因为本人也是第一次做这方面的实验,看了很多文献,具体方法如下:称取植物叶片0.2克,加入0.1克PVP,石英砂和PH6.0的磷酸缓冲液研磨,低温离心。反应体系是1.5毫升PH6.0的磷酸缓冲液,3毫升邻苯二酚,37摄氏度保温10分钟,然后加入0.5毫升酶液,迅速摇匀于398nm处测定吸光度,每分钟一次,共测3分钟,对照以蒸馏水代替粗酶液。
    • answer

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      grmm0207
      因为本人也是第一次做这方面的实验,看了很多文献,具体方法如下:称取植物叶片0.2克,加入0.1克PVP,石英砂和PH6.0的磷酸缓冲液研磨,低温离心。反应体系是1.5毫升PH6.0的磷酸缓冲液,3毫升邻苯二酚,37摄氏度保温10分钟,然后加入0.5毫升酶液,迅速摇匀于398nm处测定吸光度,每分钟一次,共测3分钟,对照以蒸馏水代替粗酶液。

      ......

      我查到一个方法,波长和你的不一样,他们用的是480nm,检测这个波长下的吸收用来衡量产物邻苯醌的浓度,你用的398nm是什么的最大吸收波长?另外,因为底物的不稳定,所以,最好再避光的条件下反应。酶的提取和反应缓冲液应该没有什么问题,这个酶的反应最佳pH就是6-7。反应后有什么现象?有明显的褐化现象吗?氧化产物按理说是有颜色的。附件里有一个方法,供参考。

      ppo activity assay.pdf(571.6k)
    • answer

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      hugang2004_2000
      我查到一个方法,波长和你的不一样,他们用的是480nm,检测这个波长下的吸收用来衡量产物邻苯醌的浓度,你用的398nm是什么的最大吸收波长?另外,因为底物的不稳定,所以,最好再避光的条件下反应。酶的提取和反应缓冲液应该没有什么问题,这个酶的反应最佳pH就是6-7。反应后有什么现象?有明显的褐化现象吗?氧化产物按理说是有颜色的。附件里有一个方法,供参考。

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      非常感谢你的帮助!反应后反应液颜色黄色,波长的选择因为各个文献的不一样,398,410,525nm的都有,会不会是操作的时候时间没控制好,比如我加酶液时时间花费太多,所以影响了结果,我再试试看吧,谢谢了!
    • answer
      grmm0207
      非常感谢你的帮助!反应后反应液颜色黄色,波长的选择因为各个文献的不一样,398,410,525nm的都有,会不会是操作的时候时间没控制好,比如我加酶液时时间花费太多,所以影响了结果,我再试试看吧,谢谢了!
      反应后的颜色是黄色的话,那就肯定超出了400nm的紫外光范围了,所以,查一下产物邻苯醌的紫外-可见光的最大吸收应该对检测波长的确定有帮助,在紫外吸收强的波长下测定误差肯定小一些,但这还要看干扰成分多不多了。
      另外,你的粗酶液提取方法中PVP的存在就是为了防止多酚被氧化的,这样一来,你的酶粗提液中的多酚氧化过程被减弱或阻止了(酶的粗提液是不是黄色的?),但是在测定活性的时候会不会也有影响?
      还有,反应时间这么短,应该需要有可以终止反应的试剂吧,要不然,等你测完一个样品,其他样品的反应时间就不至你设定的时间了。如果用酶标仪测的话,可能误差会小一些,但是反应体系不易混匀。
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