【求助】多酚氧化酶活性测定，测定结果似乎不对-Roche公司询价-蚂蚁淘生物试剂代购

留言详情

【求助】多酚氧化酶活性测定，测定结果似乎不对

能否说得详细些？用的什么试剂盒？标准品是什么？酶粗提液的制备方法？检测波长？

hugang2004_2000 2015-07-17

因为本人也是第一次做这方面的实验，看了很多文献，具体方法如下：称取植物叶片0.2克，加入0.1克PVP，石英砂和PH6.0的磷酸缓冲液研磨，低温离心。反应体系是1.5毫升PH6.0的磷酸缓冲液，3毫升邻苯二酚，37摄氏度保温10分钟，然后加入0.5毫升酶液，迅速摇匀于398nm处测定吸光度，每分钟一次，共测3分钟，对照以蒸馏水代替粗酶液。

grmm0207 2015-07-21

展开引用grmm0207 因为本人也是第一次做这方面的实验，看了很多文献，具体方法如下：称取植物叶片0.2克，加入0.1克PVP，石英砂和PH6.0的磷酸缓冲液研磨，低温离心。反应体系是1.5毫升PH6.0的磷酸缓冲液，3毫升邻苯二酚，37摄氏度保温10分钟，然后加入0.5毫升酶液，迅速摇匀于398nm处测定吸光度，每分钟一次，共测3分钟，对照以蒸馏水代替粗酶液。......我查到一个方法，波长和你的不一样，他们用的是480nm，检测这个波长下的吸收用来衡量产物邻苯醌的浓度，你用的398nm是什么的最大吸收波长？另外，因为底物的不稳定，所以，最好再避光的条件下反应。酶的提取和反应缓冲液应该没有什么问题，这个酶的反应最佳pH就是6-7。反应后有什么现象？有明显的褐化现象吗？氧化产物按理说是有颜色的。附件里有一个方法，供参考。ppo activity assay.pdf(571.6k)

hugang2004_2000 2015-07-15

展开引用hugang2004_2000 我查到一个方法，波长和你的不一样，他们用的是480nm，检测这个波长下的吸收用来衡量产物邻苯醌的浓度，你用的398nm是什么的最大吸收波长？另外，因为底物的不稳定，所以，最好再避光的条件下反应。酶的提取和反应缓冲液应该没有什么问题，这个酶的反应最佳pH就是6-7。反应后有什么现象？有明显的褐化现象吗？氧化产物按理说是有颜色的。附件里有一个方法，供参考。...... 非常感谢你的帮助！反应后反应液颜色黄色，波长的选择因为各个文献的不一样，398,410,525nm的都有，会不会是操作的时候时间没控制好，比如我加酶液时时间花费太多，所以影响了结果，我再试试看吧，谢谢了！

grmm0207 2015-07-22

grmm0207 非常感谢你的帮助！反应后反应液颜色黄色，波长的选择因为各个文献的不一样，398,410,525nm的都有，会不会是操作的时候时间没控制好，比如我加酶液时时间花费太多，所以影响了结果，我再试试看吧，谢谢了！反应后的颜色是黄色的话，那就肯定超出了400nm的紫外光范围了，所以，查一下产物邻苯醌的紫外-可见光的最大吸收应该对检测波长的确定有帮助，在紫外吸收强的波长下测定误差肯定小一些，但这还要看干扰成分多不多了。另外，你的粗酶液提取方法中PVP的存在就是为了防止多酚被氧化的，这样一来，你的酶粗提液中的多酚氧化过程被减弱或阻止了（酶的粗提液是不是黄色的？），但是在测定活性的时候会不会也有影响？还有，反应时间这么短，应该需要有可以终止反应的试剂吧，要不然，等你测完一个样品，其他样品的反应时间就不至你设定的时间了。如果用酶标仪测的话，可能误差会小一些，但是反应体系不易混匀。

hugang2004_2000 2015-07-23

我要回复